AAT Bioquest的iFluor 染料流程优化，可用于标志卵白质，高出是抗体。这些染料亮堂、耐光，对卵白质的淬灭作用最小。它们不错被荧光仪器的主要激晴朗（举例350、405、488、555和633nm）很好地引发。iFluor®647系列的光谱特质与Cy5 基本换取。与Cy5®探针比拟，iFluor 647试剂具有更强的荧光和更高的光踏实性。它们的荧光在pH 3至11畛域内与pH无关。这些光谱特质使这种新的染料眷属成为Cy5和Alexa Fluor 647的绝佳替代品（Cy5与Alexa Fluor是GE Health Care和Invitrogen的商标）。iFluor®647 SE特别踏实，与卵白质氨基具有邃密的反映性和聘任性。

艾好意思捷iFluor 647琥珀酰亚胺酯：

货号：AAT-71560

单元大小：1 毫克

分子量：1274.66

溶剂：DMSO（二甲基亚砜）

纠正因子（260 纳米）：0.03

纠正因子（280 纳米）：0.03

张开剩余84%

纠正因子（656 纳米）：0.0793

消光统共（cm -1 M -1）：250000

引发（纳米）：656

辐射（纳米）：670

量子产率：0.25

H-短语：H303, H313, H333

危境标志：XN

预期用途：仅限议论使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照袒露

库存溶液的准备：除非另有阐扬，统共未使用的库存溶液应在制备后分红单次使用的小份，并储存在 -20 °C。幸免反复冻融轮回。

卵白质库存溶液（溶液 A）：

将 100 微升的反映缓冲液（举例，1 M 碳酸钠溶液或 pH 约 9.0 的 1 M 磷酸缓冲液）与 900 微升的意见卵白质溶液（举例，抗体，卵白质浓度尽可能大于 2 mg/mL）羼杂，得到 1 毫升卵白质标志库存溶液。

驻扎：卵白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。要是卵白质溶液的 pH 值低于 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸缓冲液退换 pH 值至 8.0-9.0 畛域内。

驻扎：卵白质应融化在 1X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。要是卵白质融化在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以抗击 1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除正常用于卵白质千里淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

驻扎：不纯的抗体或用牛血清白卵白（BSA）或明胶踏实的抗体将不会被很好地标志。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可能打扰偶联反映。亚硝酸钠或硫柳汞不错通过透析或旋转柱来回除，以赢得最好的标志拆伙。

驻扎：要是卵白质浓度低于 2 mg/mL，偶联效果将显贵镌汰。为了赢得最好的标志效果，薄情最终卵白质浓度畛域在 2-10 mg/mL 之间。

iFluor™ 647 SE 库存溶液（溶液 B）：

向 iFluor™ 647 SE 的瓶中加入无水 DMSO，制成 10 mM 库存溶液。通过移液或涡旋羼杂均匀。

驻扎：在运行偶联之前准备染料库存溶液（溶液 B）。请立即使用。染料库存溶液的长久储存可能会镌汰染料活性。溶液 B 不错在避光和防潮的情况下在冷冻库中储存两周。幸免冻融轮回。

样品践诺条约：

这个标志条约是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor™ 647 SE 的偶联而修复的。您可能需要字据您的特定卵白质进行进一步优化。

驻扎：每种卵白质齐需要不同的染料/卵白质比例，这也取决于染料的性质。过度标志卵白质可能会对其连合亲和力产生不利影响，而染料/卵白质比例过低的卵白质偶联物则机灵度镌汰。

进行偶联反映：

使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（卵白质）的摩尔比例看成开首：将 5 微升的染料库存溶液（溶液 B，假定染料库存溶液为 10 mM）加入卵白质溶液（95 微升的溶液 A）的瓶中，并灵验摇动。假定卵白质浓度为 10 mg/mL，卵白质分子量约为 200KD，卵白质的浓度约为 0.05 mM。

驻扎：咱们薄情使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（卵白质）的摩尔比例。要是太低或太高，请分裂笃定 5:1、15:1 和 20:1 的最好染料/卵白质比例。

连续在室温下旋转或摇动反映羼杂物 30-60 分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-卵白质偶联物的示例条约。

字据制造商的阐扬准备 Sephadex G-25 柱。

将反映羼杂物（来自“运行偶联反映”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

当样品刚刚低于顶部树脂名义时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的 PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的样品柱纯化。归并包含所需染料-卵白质偶联物的分数。

驻扎：要是立即使用，染料-卵白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装屡次使用。

驻扎：关于长久储存，染料-卵白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-卵白质偶联物

取代度（DOS）是表征染料标志卵白质的最遑急身分。较低 DOS 的卵白质持续具有较弱的荧光强度，但较高 DOS 的卵白质也倾向于镌汰荧光。关于大大批抗体，推选的最优 DOS 在 2 到 10 之间，具体取决于染料和卵白质的性质。为了灵验标志，应适度取代度，使每摩尔抗体有 4-6 摩尔的 iFluor™ 647 SE。以下门径用于笃定 iFluor™ 647 SE 标志卵白质的 DOS。

测量接管：

为了测量染料-卵白质偶联物的接管光谱，薄情保捏样品浓度在 1-10 µM 畛域内，具体取决于染料的消光统共。

读取 OD（吸光度）在 280 纳米和染料最大接管（λmax = 656 纳米，关于 iFluor™ 647 染料）

关于大大批分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的畛域内。280 纳米的 O.D.（吸光度）是卵白质的最大接管，而 656 纳米是 iFluor™ 647 SE 的最大接管。为了赢得准确的 DOS，请确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：HeLa细胞用小鼠抗微管卵白染色皇冠体育比分现金足球app娱乐，然后用iFluorTM 647山羊抗小鼠IgG（H+L）（红色）染色；细胞核用DAPI（蓝色）染色。

发布于：湖北省